目前已有6种基于嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞的过继细胞疗法（ACT）被批准用于治疗血液系统恶性肿瘤。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞因其多种杀伤机制、更高的安全性和更广泛的来源而受到越来越多的关注。诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK（iPSC-NK）细胞具有成熟的表型和强大的细胞溶解活性，可以提供一个同质的CAR-NK细胞群体，并扩展到临床规模。因此，iPSC衍生的CAR-NK（CAR-iNK）细胞可以作为癌症免疫治疗的标准化和“通用型”产品。

NK细胞主要有四种来源：外周血、脐带血、永生化细胞系（如NK-92）和诱导多能干细胞（iPSC）来源的NK细胞，其中外周血来源又可以分为自体来源和供体来源。下表总结了不同来源的NK细胞在免疫治疗中的优缺点。

表1 不同来源NK细胞在免疫治疗领域的优缺点

细胞来源	优点	缺点
供体外周血	细胞成熟无需分化，已证明有临床疗效	分离困难，产量低
自体外周血	无同种异体反应	依赖患者免疫细胞质量，扩增困难，滞后时间长
脐带血来源CD34+细胞	可大量体外分化	未成熟，细胞杀伤毒性小
NK-92细胞系	均一细胞群，无限扩增	不表达CD16，缺乏ADCC功能，安全性未知，辐照后效果减弱
iPSC	容易获得，克隆生长、高扩增及体外分化	安全性未知

目前尚不完全清楚iPSC-NK细胞是否需要相同的激活途径来诱导脱颗粒和细胞因子分泌。尽管如此，大量数据证实了iPSC-NK 结合了原代 NK 细胞和 NK-92 细胞系最具吸引力的优势，即：高潜在的细胞毒性（包括 ADCC 功能）和即使冷冻保存后也能在体内扩增和持久存在的能力。

iPSC-NK培养方案

iPSC-NK细胞分化方案可以分为2D培养和3D培养两种，两种方式都需要通过诱导造血祖细胞（HPC）后获得NK细胞。

01    iPSC-NK 2D培养

在最早的一种方案中，Kauffman团队使用两步体外2D分化方案，将人PSCs与小鼠骨髓基质细胞共培养以促进造血分化，然后将分选的HPCs与第二步的基质细胞系和包括IL-15、IL-3、IL-7、SCF和Flt3L的细胞因子混合物共培养以产生PSC衍生的NK细胞。其他组已经用表达Notch配体DLL1或DLL4的基因工程饲养细胞取代了第二步的基质细胞系，这些工程改造的细胞可以促进HPCs向NK谱系的分化和扩增

在2D培养方案中，饲养层体系因其高分化效率在基础研究中应用广泛。饲养层细胞能分泌生长因子和细胞因子，促进干细胞特定方向分化，为研究者提供丰富的细胞资源。然而，其在临床应用中因安全性问题受限，如可能携带病原体、引发免疫排斥等，因此，临床研究者们更倾向于采用更为安全、可控的培养方案。

在非饲养体系中，干细胞的增殖和分化高度依赖于外源添加的细胞因子，通过在培养基中添加BMP4，VEGF，FGFb，TPO，IL-11，IGF-1，SHH，Transferrin等细胞因子，促使iPSC分化成为造血干细胞。然后添加IL-15，IL-3，IL-7，SCF，Flt-3L等多种细胞因子诱导其分化生成NK细胞。

02    iPSC-NK 3D培养

在3D培养方案中，iPSC在没有饲养层（低吸附板）的悬浮液中培养时，它们会自发地形成拟胚体（EB），EB中的细胞响应外源性细胞因子信号，生长和分化为特定的细胞谱系，在DLL4蛋白包被的板子和包含细胞因子的分化培养基中最终得到NK细胞。

                  iPSC分化为NK细胞的3D方案示意图

通过无饲养层体系胚状体形成方法将iPSC分化为NK细胞，简单的培养过程如下：未分化的iPSC细胞克隆使用TrypLE select处理后转移至低吸附板，并在含有10μmol/L Y‐27632的iPSC培养基中孵育过夜，以形成胚状体（EB）。收集EB并将其转移到EB培养基中，并在40 ng/mL BMP‐4、10 ng/mL bFGF和50 ng/mL VEGF的存在下培养。第4天，EB与细胞因子混合物（50 ng/mL SCF、20 ng/mL Flt3L、20 ng/mL IL‐3和30 ng/mL TPO）一起培养。在培养的第14天，将分化的细胞转移到FcDLL4包被的培养板上，并在细胞因子混合物（10 ng/mL Flt3L，5 ng/mL IL-7）的存在下培养。培养21天后，造血细胞分化为CD7+、CD45+淋巴细胞祖细胞（iLPC）。采集iLPC并用PHA刺激其扩增以产生iNK^[5]（图3）。

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