二代测序近年来飞速发展，做过文库构建的小主们，是不是曾经深受文库产量低、质量差、测序数据不好这些问题的困扰？如何一步步排查问题，找到症结并优化呢？

别着急，小编在这里为大家整理了NGS文库构建中的连接模块正确测评方法及连接效率的影响因素，看完以后大家就对接头连接有全局的把握，排除连接模块对文库的影响更是不在话下！

说到接头连接，就得从文库制备的概念说起了……

文库制备（Library Preparation）就是在DNA片段两端连上特定序列的接头（两侧的序列不同）的过程。

在连接接头过程中，不是所有的DNA片段都能两端接上接头，接头连接效率的概念在这里就要引入了。接头连接效率是指在DNA片段两端均加上测序接头的DNA量占起始总DNA量的比值。它是影响文库产量的重要指标之一，对文库的质量和产量具有重要的影响。若连接效率低，那么未连上接头的DNA片段无法得到PCR扩增；连接效率越高，代表文库转化率越高，可以说，接头连接效率直接影响最终的文库复杂度和有效测序数据。

接头连接效率这么重要，要如何对连接效率进行正确的测评呢？

1.一般连接效率的评测方法

方法一：对比连接前后文库的量。

指的是测定接头连接前的文库量，然后进行接头连接，纯化后测定剩余的文库量。这类方法被很多人使用，实际上却存在很大的问题。通常连接后文库中，会存在接头、未连接接头片段或者单端连接接头的文库，通过Qubit荧光定量，只能确定总的双链DNA量，无法确定有效的双端连接接头文库的量。因此此方法会与实际结果存在巨大误差。并且磁珠的纯化也有一定的文库损失，具体效率无法准确把控。

方法二：更换连接模块做平行测试。

指的是通过更换不同的连接模块，对比最终文库产量，来评测不同连接模块的连接效率高低。同样，这类方法也存在一些弊端，首先这种方法无法排除不同连接模块与原体系的兼容性对产量的影响，其次这种方法只能间接的反映哪种连接模块更有优势，无法评测具体连接模块的连接效率。

总结：

以上两种接头连接的测评方法其实都犯了一类错误：将关注点放在文库的产量上面而不是具体连接上接头片段的比例。这是因为接头的连接不仅要看接头连接的文库的产量，更要看连接文库的效果，而后者才是评估连接效率的关键因素。

方法一：Agilent 2100检测连接峰图法

小编对此做了测试，对已知片段大小的DNA片段（350bp）进行接头连接，文库在连接接头后进行Agilent 2100检测，结果表明，虽然文库连接上了接头，但是只有两端均连接上了接头的文库才能被扩增和测序。当未连接或单端连接接头的含量很少时，或者双端连接接头的文库含量高时，代表接头连接的效率越高。

方法二：qPCR定量法

qPCR法定量文库的方法是以qPCR为基础，通过标准曲线的校准，精确定量文库中用于双端完整接头的文库数量。因为此方法使用的引物为通用序列，若只有一端连接接头或未连接接头的文库是无法得到扩增，也就是无法检测到荧光值，最终浓度是将这部分文库排除。此方法可以精准的测定文库中成功连接接头的文库数量，以此可以精准的评测连接的效率情况。

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